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文|胡叁叔
编辑|胡叁叔
前言
全球土壤盐碱化程度日益加剧，它是限制农作物生产的主要环境因子。
因此，发掘与之有关的耐盐基因，已成为人们努力的方向。
在对拟南芥、水稻等植物抗盐碱分子机制的进一步研究中，已克隆出了这些植物中存在的液泡膜Na+/H+逆向输送蛋白基因，并确认了它们具有很高的耐盐能力。
角碱蓬（）是一种以耐受高盐胁迫而闻名的草本植物，分布于黑龙江、吉林、新疆、甘肃等多个地区。
鉴于国内外还未有红豆杉液泡膜Na+/H+反转运体的相关研究，故我们首先从盐生红豆杉中获得Na+/H+反转运体NHX1，并将其转入烟草中进行验证，为红豆杉NHX1的应用奠定基础。
材料与方法
角碱蓬（）产于吉林省松原（）的盐碱地；日本烟叶K326（日本烟叶）的种籽，目前已被东北师范大学植物研究所收藏。
本研究采用东北师范大学生物技术研究所自行建立的重组质粒；从大连宝生物株式会社获得pMD18-T载体。
DNA限制内切酶小牛肠道胶体循环和质粒萃取测试盒，等都是大连保生物公司的产品。
从Neb-获得T4DNA连接酶；上海生工生化科技公司采购了氨西西林和卡那西林；试验中使用的其它化学物质都是国内生产的。
1.1.4培养基
以角碱蓬NHX1的全长为基础，利用Fast-PCR3.0版本的软件，对其进行了以下设计。
上游引物：5–3；下游引物：5—3。
采用RT-PCR技术对其进行PCR，得到NHX1的cDNA片段，将其与pMD18-T进行重组表达，经E.coli萃取质粒酶切技术对其进行验证。
PCR反应系统（50uL)：1.5µL的前一步骤的CDNA、1µL的上行（/wL）、1µl的下行（20n摩尔/µL）、5µl的、0ul的Taq酶（025µL的dNTP）、1µL的ddH（040.25µL的）。
用XbaI和SacI双酶切载体35s启动子，分离出编码GFP的基因片段并回收，将载体上的GUS基因用双酶切，回收。
然后，将GFP基因片段与连接转化大肠杆菌、筛选重组子、酶切鉴定重组子、构建成含有GFP荧光标记的植物表达载体，重组质粒命名为。
利用Xbal对pMD-NHX1进行纯化，利用Xbal对进行去磷酸化处理，获得NHX1的正向插入到中，并对其进行功能验证，从而获得NHX1的转基因植株。
将2克的转基因植物和对照组植物的叶子放入研罐中，用液态氮进行完全的粉碎。采用王关林等人的DNA萃取技术，可供参考。
以1g的基因组DNA为PCR扩增模板，采用2组引物进行PCR扩增，其顺序为NPTII基因5–3'、5'-CA-3、GFP基因。
NPTII的反应过程在95摄氏度下进行5分钟预变，接着再进行32次，每次分别是94摄氏度30秒、57摄氏度30秒、72摄氏度30秒、72摄氏度5分钟和72摄氏度5分钟。
GFP基因扩增程序为95预变性5min，然后为32个循环，每个循环为94℃30s、60℃30s、72℃30s、72℃5min。在PCR扩增结束之后，用1.2%的琼脂糖对其进行了电泳分析。
将转基因植物与对照植物的根尖端置于玻璃上，用型正向荧光显微镜及-进行GFP检测。
结果和分析
采用所设计的引物，从红豆杉基因组中克隆出红豆杉NHX1基因的全长、两端各含Xbal及SacI酶切位点的红豆杉NHX1基因。
其编码区域的全长测序结果见图1-A；将此序列与pMD18-T载体相结合（图1-B)，选择合适的阳性无性系，以建立植物表达载体。
用Xbal及SacI对进行酶解，得到800bp左右的绿色荧光蛋白基因。
将该基因的表达子用Xbal及SacI进行双酶解，得到了800个碱基的片断35s启动子，并进行图2-A的鉴别。
利用Xbal、SacI等对该重组蛋白进行双酶解，获得GFP靶基因，通过对其进行了凝胶电泳，确定它与蛋白结合。
最终，获得了具有GFP功能的蛋白，并将其与蛋白结合，从而获得了一个高效的蛋白，见图2-B。
利用对进行酶切获得NHX1基因序列，对其进行表达后获得重组基因。
利用Xbal-+Smal双酶切技术，对该重组子进行正性表达分析，得到目标基因NHX1及+35s启动子区，鉴定结果如图3所示。
采用电催化技术，将-NHX1基因转入农杆菌感受性细胞，并利用Xbal内切酶对其进行了单酶切鉴定。
试验可得到一个NHX1靶基因的片段，结果如图4所示。
将质粒-NHX1转人到农杆菌中，利用农杆菌侵染烟草叶盘的方法，成功在含有卡那霉素筛选培养基上筛选出抗性小芽。
将此抗性小芽转移到根系培养基中，待它长出健壮的根后移入花盆中进行炼苗，结果见图5。
为了证明该方法的有效性，我们选择了6个转基因的烟草种质资源，采用了两对引物，分别对NPTII和GFP基因进行了PCR扩增。
研究发现，5株抗性植株可扩增出与NPTII和GFP基因对应的500bp和550bp片段(泳道3~8)，只有1株(泳道7)，没有扩增结果(图6和图7)。
该PCR扩增的结果不但说明了该系统具有较高的转化率，而且证实了该系统确实将异源基因，导入到了烟草的基因组中。
本研究构建的-NHX1载体，再下游带有绿色荧光蛋白(GFP)基因，该基因的表达状况可以直接反映目的基因NHX1的表达。
抗性转换植物的根尖端用荧光正向显微镜（图8）检测。实验证明，绿色荧光蛋白基因在转基因植物中得到了有效的表达，并得到了初步的证实。
结论
在前期工作中首先获得红豆杉Na+/H+逆转运体NHX1，并利用GFP技术获得红豆杉Na+/H+逆转运体NHX1。
前期的转化实验结果显示：从红豆杉中获得的NHX1基因被成功转入到了烟草中。
在6个转基因植物中，5个进行了表达，1个不能进行转化，证明了我们所构建的转化系统具有较高的转化效率。
这一结论与其它Na+/H+逆向运输蛋白NHX1基因，在烟草中的表达情况是吻合的，而角碱蓬NHX1基因也在转基因耐盐性植株中的运用奠定了基础。
参考文献：
[1]施华中,杨弘远,周嫦,等《根癌农杆菌的高效电激转化》
[2]王关林，方宏筠《植物基因工程》
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