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站 长 微 信： muyang-0410
期刊：
IF：7.9
中科院大类分区：医学2区
通讯作者：Xiao-qi Huang , Xue-bao Zheng
DIO：10.1016/j..2022.
研究背景
溃疡性结肠炎(UC)是一种以肠道炎症和肠上皮结构破坏为特征的炎症性肠病(IBD)，这是一种慢性、反复发作的疾病，影响着数百万患者。虽然UC的病因尚未确定，但其发病机制是多因素的，包括免疫反应失调、上皮屏障缺陷和遗传易感性。UC的临床治疗包括生物制剂、水杨酸盐和免疫调节剂，然而，由于药物的副作用，它们的使用受到限制，因此，确定减轻与临床治疗相关的毒副作用的替代药物至关重要。
由于临床药物对UC的疗效有限，中药多成分、多靶点的治疗作用逐渐得到研究者的认可。黄芩汤(HQD)是最早出现在《伤寒论》中的中药方剂，先前的研究表明，HQD可以改善化疗引起的胃肠道毒性。它还通过调节葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的UC小鼠中的肠道微环境来减轻炎症。肠道菌群失调是UC发病的起始和持续因素，其代谢物具有抑制炎症反应和调节免疫的作用，成为近年来研究的热点。
本文旨在研究HQD对3%葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠7天结肠炎的影响，并进一步探讨其代谢产物对DSS损伤的FHC的细胞的抑制作用。
研究内容
HQD的制备与组成：
HQD由黄芩(90g)、芍药(60g)、甘草(60g)和枣粉(490g)四种天然药用植物组成。所有草药在纯水中煮沸两次，每次30分钟；滤液浓缩至1 g/mL, 4℃保存。采用高效液相色谱法对其成分进行分析。
一、HQD改善了DSS诱导UC模型的表现
1.DSS诱导HQD模型及治疗
雄性Balb/c小鼠(6-7周龄)在SPF环境下适应喂养7天。小鼠随机分为6组(n=8)：对照组、DSS组、5- ASA组和低、中、高剂量HQD组。HQD的剂量分别为9.1 g/kg、4.55 g/kg和2.275 g/kg。从第1-7天开始，给药组口服不同浓度的药物，对照组和DSS组给予生理盐水。对照组在实验期间给予纯净水，其余各组饮用3%的DSS溶液。
2.表观生物状态评分：
每天监测小鼠的健康状况，实验期间每日进行疾病活动指数(DAI)评分。
在造模和给药后，将结肠从回盲瓣处剥离至下直肠末端，并测量长度。部分结肠采用苏木精-伊红(H&E)染色，其余结肠纵向解剖，并进行标准评分，部分结肠快速冷冻进行Wb。此外，盲肠内容物被快速冷冻并保存在-80◦C，直到进一步检测。
3.H&E染色
将4%多聚甲醛保存的结肠包埋于石蜡中，切片成5 μm厚的切片，H&E染色。显微镜下观察结肠的形态变化(肠上皮、黏膜下层、肌层、绒毛、隐窝)。
结果显示：各组之间的食物和水的消耗没有显著差异(图1B, C)。与初始体重相比，HQD治疗后小鼠体重增加(图1D)，而HQD治疗后DAI评分下降(图1E)。HQD治疗后结肠延长的趋势具有统计学意义(图1F, G)。H&E染色切片显示，HQD恢复了dss诱导的结肠绒毛形态和隐窝损伤(图1H)。HQD治疗组明显缓解了病理状态(图1I)。综上所述黄芩汤，结果表明HQD治疗改善了UC小鼠的表现。
二、HQD上调了肠道菌群的丰度
通过宏基因组分析盲肠内容物中微生物群的多样性，对基因序列进行了物种注释，并进行了差异比较、聚类、物种组成丰富度、均匀度和关联网络分析。
如图2A所示，韦恩图显示，样本共有5642种共同物种。ACE和Chao1指数显示(图2D)，HQD处理DSS诱导小鼠的菌落丰富度高于DSS组，说明HQD恢复了肠道微生物群的原始丰富度。基于OTU丰度，采用主成分分析(PCA)(图2B)确定各组间微生物群落的总体差异。OPLSA-DA计分表(图2F)直接反映了组间和组内的差异。采用β-多样性分析(包括PCoA和NMDS)(图2C、E)来评估微生物群结构的差异。在物种水平上，在物种水平上，PCA和PCoA表明，三组间肠道细菌群落的处理和结构差异显著(p < 0.01、p < 0.01和p < 0.01)。这些结果表明，HQD在物种水平上显著上调了细菌的丰度，但DSS和HQD处理对肠道微生物群的特异性没有影响。
在门和物种水平上绘制了每个样本中优势物种组成的直方图，每个直方图代表一个样本，并通过颜色区分分类群，纵坐标表示各类群的相对丰度。如图3A和B所示，DSS组相对丰度降低，相对丰度升高;但经HQD处理后，两门呈相反趋势。
利用工具对优势菌进行热图分析(图3C)，经HQD处理后，优势菌(包括)丰度呈上升趋势。
为了阐明队列中的差异，使用效应大小(LEfSe)的线性判别分析(LDA)来确定影响最大的观察值(图3D、E)。 和 在门水平上以及 , sp YL32和 在种水平上影响最大。
这些结果表明，HQD可能通过恢复优势菌的丰度来调节肠道菌群，达到新的平衡。
三、HQD增加了DSS诱导UC模型中氨基酸代谢物的水平
对盲肠内容物进行代谢组分析。图4a和b显示组脂肪酸、有机酸、短链脂肪酸(SCFAs)、氨基酸和碳水化合物的代谢上调。选择差异氨基酸代谢物p 1, VIP > 1。
研究发现，组有12种氨基酸含量增加。HQD可能通过调节氨基酸代谢途径来缓解UC模型的炎症症状。
四、代谢物促进了DSS诱导的FHC细胞的体外增殖
UPLC-MS/MS代谢组学显示，HQD处理后氨基酸代谢显著上调。选择四种代表性氨基酸(包括L-赖氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-谷氨酸)进行体外验证。
FHC细胞系是肠上皮细胞(IECs)的典型模型。CCK-8实验结果显示，HQD(0~400 μmol/ mL)、HQD盲肠含量(0 ~ 400 μmol/ mL)和氨基酸(0 ~ 400 μmol/L)对FHC细胞活性无抑制作用。然而，每种物质都能修复DSS诱导的受损细胞(图5A-F, p < 0.01)。如图5G所示，DSS组(M组)细胞间隙变宽，细胞间连接消失。
结果表明，盲肠内容物(F组)和氨基酸处理显著恢复了FHC细胞的形态，增加了细胞间连接。
五、代谢物在体外抑制DSS诱导的FHC细胞凋亡
研究盲肠内容物和氨基酸处理是否能改善DSS诱导的FHC细胞凋亡。流式细胞术结果显示黄芩汤，DSS刺激后凋亡细胞比例显著升高，盲肠内容物处理将DSS诱导的FHC细胞凋亡逆转至15.1%，氨基酸处理分别逆转至20.8%、17.7%、22.1%和23.2%(图6)。盲肠内容物和氨基酸处理消除了DSS暴露后Bcl-2、Bax和 -3的变化。
综上所述，研究结果表明盲肠内容物和氨基酸通过调节凋亡相关蛋白的表达来减轻DSS激活的FHC细胞损伤和凋亡，而 -3、Bcl-2和Bax是参与细胞保护的潜在调节剂。
六、HQD在体内激活mTOR通路，代谢产物在体外激活mTOR通路
HQD处理后，结肠炎小鼠体内mTOR通路被激活(图7A)，氨基酸代谢产物在体外对DSS诱导的损伤细胞中的mTOR通路有正调节作用(图7B)。
HQD治疗后p-mTOR/mTOR比值明显上调。 分析显示，与DSS组相比，HQD组p-PI3K/ PI3K和p-Akt/Akt比值显著升高。mTOR的效应物S6和4E-BP1也得到了类似的结果。这些结果表明，HQD治疗后mTOR活性增加。
检测盲肠内容物和mTOR通路中氨基酸的作用。如图7B所示，评估了细胞存活相关蛋白(包括PI3K、Akt和mTOR)的水平。盲肠内容物和氨基酸增加了p-mTOR、p-PI3K、p-Akt、p-S6和p-4E-BP1的表达。
七、HQD及其代谢物在体内和体外修复上皮屏障
ZO-1、和-1是关键的紧密连接蛋白。在图7A中，HQD处理显著增加了ZO-1的表达。HQD上调和-1的表达。E-是粘附连接处的标记物，HQD促进了E-在细胞-细胞连接处的积累，增强了肠道结缔组织的自我更新。HQD给药后细胞间紧密连接的恢复减少了有毒物质进入结肠，从而减少了结肠损伤。
如图7B所示，检测FHC细胞中连接蛋白的表达。盲肠内容物和氨基酸处理后，四种蛋白(ZO-1、、-1和E-)上调。上皮屏障的修复可能与mTOR通路有关被氨基酸代谢产物激活，研究结果表明HQD通过调节小鼠氨基酸代谢，改善DSS诱导的UC。
总结
本文通过研究得到，HQD在体内抑制DSS诱导的结肠炎的炎症，减弱DSS诱导的临床表现，逆转结肠长度缩短，并减少组织学损伤。HQD处理后，DSS诱导的肠道生态失调得到了调节，肠道菌群达到了新的平衡状态。此外，HQD通过上调氨基酸代谢激活mTOR信号通路。HQD调节的代谢产物通过抑制DSS诱导的FHC细胞凋亡和调节影响凋亡和细胞-细胞连接的蛋白质来保护上皮屏障的完整性。
HQD通过激活mTOR信号通路，抑制结肠上皮细胞凋亡，愈合伤口，从而缓解UC。这种激活可能是氨基酸代谢调节和肠道微生物群的结果。作者的研究成果为该中药方剂的抗UC作用提供了新的见解，进一步证实了HQD的传统应用，并有助于其抗UC的药理学验证。这些发现表明，HQD有潜力进一步发展成为治疗UC的替代方案。
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