细胞周期运行机制，是细胞分裂的驱动力，其核心包括细胞周期蛋白、细胞周期蛋白依赖性激酶和其他组成部分。越来越多的证据表明，不同的细胞有不同的细胞周期运行机制，尤其是干细胞，周期运行模式独特；同时近年研究又表明，这些独特的细胞周期运行方式与干细胞的自我更新和多向分化潜能等特性和功能有关。从细胞周期研究的角度，来探索认识干细胞中的生命活动，将对干细胞研究和应用领域起到重要推动作用。
2019年9月2日，美国哈佛大学医学院Piotr Sicinski教授联合中国东北大学生命科学与健康学院刘丽君教授在Nature Cell Biology杂志发表了一篇题为The Cell Cycle in Stem Cell Proliferation, Pluripotency and Differentiation的综述，详细讨论总结了细胞周期运行机制在胚胎干细胞、诱导性多能干细胞或胚胎神经干/祖细胞中，如何参与并调控细胞增殖、多能性和细胞命运决定等过程。
胚胎干细胞中的细胞周期调控机制
在胚胎发育过程中，细胞周期模式会不断发生变化。蝇类、鱼和青蛙发育过程中的第一个细胞周期很短，没有明显的间期，仅由交替的S和M期组成。小鼠胚胎相关分析表明，着床前胚胎细胞的分裂期极短（不超过4.4~7.5小时），且只有极少数细胞处于G1期；有趣的是，第一、二个细胞周期较长，而第三个显著缩短；到发育后期，随着原肠胚的形成，和内、中、外胚层的出现，细胞周期的长度随着间期的延长而显著增加。
小鼠胚胎干细胞（mESCs）来源于囊胚内细胞团，在适当的体外培养条件下，能够保持独特的细胞周期结构：快速分裂（~12小时），虽然不及体内的同类细胞快；G1期短，仅持续3小时。在分子水平上，与体细胞相比，mESCs中细胞周期蛋白（cyclin）E、A和B的表达水平以及细胞周期蛋白依赖性激酶（Cdk）1和2的活性均显著升高。值得注意的是，在mESCs中，cyclin E和A在整个细胞周期中持续高表达；而Cdk2，即cyclin E和A的相关激酶，在整个细胞周期中被持续激活，这些都与它们在体细胞中周期性的表达或被激活方式不同。mESCs 中唯一保持周期性的cyclin/Cdk复合物是cyclin B-Cdk1，且其活性水平明显高于体细胞。由于mESCs中过度活化的Cdk1和Cdk2，视网膜母细胞瘤蛋白1（RB1）在整个细胞周期中处于磷酸化的失活状态，因而E2F被持续激活（图1）。
导致mESCs中Cdk1和Cdk2激酶活性较高的可能的机制如下。首先，与体细胞相比，mESCs中不表达Cdk1/2的抑制剂KIP/CIP。其次，mESCs中表达高水平的APC/C抑制剂Emi1，使APC/C活性降低，进而促进S期细胞周期蛋白以及另一个APC/C靶点Skp2的积累。反之，Skp2介导p27Kip1的降解，从而进一步促进Cdk1/2激酶活性的升（图1a）。
早期研究表明，mESCs表达较低水平的cyclin D，并对于p16INK4a细胞周期的抑制作用不敏感；在体内，原肠胚形成之前，小鼠胚胎不表达cyclin D。但也有报道称，cyclin D1和D3在小鼠外胚层多能干细胞中有表达；另外，Cyclin D3在mESCs中也有表达，且能够与Cdk6形成复合物。恒河猴ESCs也有与上述类似的细胞周期特征。应该注意的是，这些研究中ESCs都是在血清和白血病抑制因子（LIF）存在的条件下培养的。而最近的研究表明，在含有MEK和GSK3激酶抑制剂的特定培养基中培养的mESCs的状态更接近真正的多能性，具有较长的G1期和低磷酸化的RB1，被称为“ground”状态，不同于在血清和LIF中培养的细胞。这一令人惊讶的发现提示我们需要对不同条件下培养的mESCs与体内的早期胚胎多能干细胞进行更多的比较。
而人胚胎干细胞（hESCs）中的细胞周期调控机制略有不同，这可能因为hESCs来源于着床后外胚层末层的“初始”多能干细胞，而非囊胚内细胞团；而在早期发育过程中存在多种形式的多能干细胞，它们的细胞周期机制也可能有所一些差异。与mESCs类似，hESCs也增殖迅速，G1期较短，CDK1和CDK2激酶活性水平高。不同的是，hESCs中cyclin D和KIP/CIP抑制剂的表达水平较高，Cdk2激酶活性呈细胞周期依赖性波动g0期细胞，Rb1具有高低磷酸化的状态（图1b）。
图1. 体细胞（MEFs）和人/鼠ESCs的细胞周期
细胞周期与干细胞多能性的分子联系
“细胞周期与多能性”领域的一个重要问题是：多能干细胞特有的细胞周期只是使其细胞数量增多，还是在维持其多能性方面也有作用？有研究表明cyclin可以增加细胞的多能性。敲除CDK1、CDK2、cyclin E或B1，或使用CDK抑制剂都会使细胞丧失多能性并开始分化，而cyclin E或B1的异常高表达会促进ESCs的自我更新。但是，上述研究中的其中一些操作导致了细胞周期停滞、紊乱，或细胞凋亡，从而可能混淆了结果。其次，有研究表明CDK1通过调节PI3K/Akt通路维持其多能性。相反，还有研究表明CDK1通过涉及Aurkb和PP1的一种间接机制抑制Oct4与染色质的结合。此外，对cyclin D或E缺失mESCs的研究也进一步证实了细胞周期可以调节细胞的多能性。尽管敲除所有3个D类（D1–/–D2–/–D3–/–）或2个E类（E–/–E2–/–）cyclin对多能性没有影响，但五种G1 cyclins的全部缺失却会导致mESCs多能性的显著衰减。值得注意的是，缺乏所有G1 cyclins的细胞可在体外增殖，尽管增殖速率有所降低，表明cyclin D和cyclin E对mESCs的增殖不是必需的。进一步研究表明，G1 cyclin-Cdks能够磷酸化多能性因子Oct4、Sox2和Nanog，所以G1 cyclins的缺失显著降低了Oct4、Sox2和Nanog的磷酸化水平，使它们被蛋白酶体降解，导致mESCs多能性的衰减（图2）。
虽然G1 cyclins对mESCs的增殖不是必需的，但是在cyclin A缺失后没有观察到mESC克隆，这与成纤维细胞的研究结果相反，成纤维细胞的增殖需要G1 cyclins，cyclin A对其不是必需的，因为cyclin A的功能可以由cyclin E代替。总的来说，与体细胞不同，G1 cyclins对维持mESCs细胞周期不是必需的，但能够参与维持其多能性。
除了cyclin调控多能性因子，多能性因子Nanog和Oct4也可以反过来影响细胞增殖。在hESCs中，Nanog可以与CDK6和CDC25基因的调控区结合并上调其表达，从而促进细胞增殖。Oct4可以通过抑制细胞周期抑制基因p21Cip1的表达促进细胞生长。但另一项研究却称Oct4通过与cyclin-CDK1形成复合物来抑制CDK1的激活，从而抑制细胞增殖。多能性因子还可以间接影响细胞增殖。例如，Oct4和Nanog可以上调c-Myc，进而调节细胞周期相关基因的表达。
图2. 细胞周期与体细胞重编程和多能性维持
多能性的衰减与细胞命运特化
当ESCs经历细胞命运特化和分化时，其独特的细胞周期结构会随着多能性的衰减而改变。在此过程中，由于G1期的大幅延长，细胞周期的长度也增加。并且，Cyclin D表达上调，CDK1和CDK2的活性下降，其部分原因为KIP/CIP抑制因子的表达。同时，CDK2、cyclin E和A的依赖性激酶也仅在特定的周期阶段激活。Emi1的下调导致APC/C活性增加，促进其靶基因如cyclins的降解。最终导致在G1期仅出现低磷酸化的RB1，并使E2F的转录活性受到严格的细胞周期依赖性调控。
利用FUCCI系统的一项研究发现，ESCs在G1期开始分化，G1期细胞中发育调控相关转录因子的表达水平升高，提示G1期ESCs可能处于“谱系启动”状态。ESCs中的一些发育调控基因可被组蛋白标记物激活（H3K4me3）和抑制（H3K27me3）。在G1晚期，许多发育相关基因上的激活性H3K4me3标记增加，导致其转录水平增加，因此能够促进分化。此外，在G1期，一些发育相关基因的胞嘧啶5-羟甲基化增加，这可能与其高表达相关（图3）。
综上研究结果推测G1期可能是决定细胞命运的初始阶段，G1期的延长可能导致多能性的衰减和分化关键因子的积累，相反，缩短G1期会使分化促进信号的影响降低，并有助于维持其多能性。Pauklin等人的工作进一步证实了这一推测，他们的实验结果显示，在hESCs的G1早期，当cyclin D还没有表达时，Smad2和Smad3转录因子结合并激活内胚层基因，从而引导内胚层分化；而在G1晚期，cyclinD-CDK4/6激酶上调，导致Smad2/3磷酸化，从而阻止其进入细胞核，进一步抑制了细胞向内胚层分化，使细胞只对神经外胚层的分化敏感。此外，cyclin D还可通过不依赖CDK4/6和Smad的机制来调控细胞命运。例如，cyclin D1利用转录激活因子来影响神经外胚层基因，从而促进神经外胚层的分化；同时也可与内胚层基因的启动子结合并激活转录共抑制因子，从而抑制内胚层分化（图3）。事实上，cyclin D1已被证明可以与基因调控区相互作用，并以不依赖于CDK4/6的方式调节体内的基因表达。
另外，有些研究结果与上述有所不同。例如，缺乏单个cyclin D、或所有cyclin D（D1–/–D2–/–D3–/–）、或Cdk4和Cdk6（Cdk4–/–Cdk6–/–）的敲除小鼠，都可以发育到妊娠中期并形成各种器官，表明细胞命运特化未受影响。此外，在缺乏所有cyclin D的mESCs中，细胞分化标志物并未上调。但是，mESCs中G1 cyclins的缺失导致神经外胚层基因表达增加，并在体内嵌合胚胎和畸胎瘤实验中也显示出向神经细胞分化的倾向性，这一结果与shRNA介导的hESC中cyclin D沉默的结果相反。此外，其他研究也证实cyclin D–CDK4/6的活性抑制了体内神经外胚层的分化，而其沉默则促进了神经外胚层分化。这些差异可能是由小鼠和人类细胞中谱系特化的分子机制不同造成的。
虽然G1期细胞易分化，但是与S期和G2期相关的通路可能会抑制多能性的衰减。在分子水平上，cyclin B1可能是G2期多能性促进通路中的一个重要组分（图3）。Van Oudenhove等人的研究表明，在G2期，由于CDK1激酶抑制蛋白Wee1的上调，因此多能性促进机制减弱，导致ESCs向中胚层或内胚层细胞的分化过程中止。
图3. 多能性衰减和细胞分化过程中的细胞周期
体细胞重编程过程中细胞周期的改变
转录因子Oct4，Sox2，Kif4和c-Myc的表达，可以将体细胞逆分化成诱导性多能干细胞（iPSCs）（图2），这一过程被称为体细胞重编程，伴随其的早期事件之一是细胞周期运转显著加快。Guo等人证实，在小鼠成纤维细胞重编程过程中，超快分裂细胞亚群（细胞分裂时间约8h）占重编程细胞的99%以上。另有研究表明，可以通过分选高速增殖的细胞，来提高重编程的效率。这表明，细胞周期的加速（只发生在一小部分细胞中）可能是重编程中的一个速率限制因素。有实验指出，过表达cyclins和CDKs的可以提高了重编程效率，而敲除则具有相反的效果。此外，原代小鼠成纤维细胞在连续传代后增殖变慢，而重编程潜能也下降；反过来，通过pARF/p16INK4a，p53或p21CIP1的失活，加快其细胞周期，能够增加重新编程效率。
被CDK2介导磷酸化的Sox2能够与其它因子结合，来共同促进在重编程过程建立多能性的能力，这与cyclin E- CDK2提高Sox2蛋白稳定性的观察一致。另有研究显示，cyclin B1和CDK1通过上调和维持重编程因子Lin28的表达在体细胞重编程中发挥限速作用。而Rb1的失活通过与细胞周期无关的机制促进重编程，这与Rb1直接结合多能性基因以抑制其表达的能力有关。
iPSCs的细胞周期结构与ESCs相似，即分裂时间快，G1期短 (~2.5h) ，CDK1的缺失也削弱其多能性等。这些表明，在重编程过程ESC式细胞周期模式的出现，与多能性的获得相关。然而，cyclins如何帮助iPSCs获得和增强多能状态的分子机制却仍不明确。
神经干细胞的细胞周期机制
与ESCs类似，胚胎神经干/祖细胞的细胞分裂时间短（约8h）。但有趣的是，有一类分裂缓慢的神经祖细胞亚群，也可以产生成熟的神经干细胞（NSCs）。细胞周期抑制剂p57Kip2的表达对于维持缓慢的细胞分裂和成熟NSCs的分化是必要的。随着发育的进行，由于G1期的长度增加，细胞周期长度也随之增加（约18h）。
Cyclin D1、E1或CDK4的异位过表达，会增加细胞的自我更新并抑制神经性分化，从而防止G1期生理性延长。相反，cyclin D1和CDK4的缺失，或加入CDK4抑制剂可以刺激神经发生。同样地，Cdk2 / Cdk4双敲除小鼠的NSCs向神经元分化的倾向增加，导致这些胚胎的脑中神经性分裂增强。有趣的是，对发育中的灵长类动物皮层的研究表明，位于不同区域的神经元前体中cyclin E和p27Kip1表达分布的变化与其细胞周期长度（尤其G1期长度）相关，表明特定区域内cyclin E相关激酶的活性水平可能影响该区域神经发生。
上述所有研究都提示，cyclin/CDK激酶的活性能够抑制神经元分化。Lim等人提出在自我更新的NSCs中，高表达的CDKs磷酸化Sox2，从而增强Sox2抑制神经元分化的能力。当CDK的活性降低时，Sox2转变为非磷酸化状态，引发酶解反应g0期细胞，生成的截短Sox2结合并反式激活原位基因，从而促进神经发生（图4）。Ali等人假定在快速增殖的神经干/祖细胞中，cyclin A和B依赖性激酶磷酸化神经元碱性螺旋-环-螺旋转录因子神经元2（Ngn2，神经元分化的主要调节因子），这种磷酸化抑制了Ngn2结合神经源性基因和促进神经发生的能力。基于此模型，延长G1期长度和降低CDK活性，会减轻这种抑制，并使Ngn2开启向神经方向分化。有意思的是，Ngn2可以抑制cyclin D1和E2的表达，这说明有一个正反馈循环发生在神经分化过程中，以强制细胞退出细胞周期。
值得注意的是，有与上述相反的观点，即在鸡胚胎的脊髓中，cyclin D1通过由Hes6介导的细胞周期非依赖性功能促进神经分化。而且，前面也有提到，Pauklin等人报道在hESCs中，cyclin D1和CDK4能够促进神经源性分化。
除cyclins和CDKs外，其他细胞周期相关蛋白也在神经形成中起作用。例如，p27Kip1可以通过不依赖于其抑制CDK的功能而稳定Ngn2蛋白来促进神经元分化。相反地，相关抑制剂p57Kip2与前列腺碱性螺旋-环-螺旋因子Mash1相互作用并抑制其转录活性，从而抑制神经发生。此外，RBL1蛋白通过抑制Notch1途径调节哺乳动物大脑中的神经前体细胞。最后，CDK抑制剂p27Kip1、p57Kip2和RB1在调节神经元细胞迁移中都发挥着不依赖于细胞周期的功能。
与本篇综述中所关注的增殖快速的ESCs相反，成熟机体内的组织特异性干细胞基本上处于静止状态。有人提出，它们的G0阻滞与ESCs中的G1期截短具有相同的目的，即限制细胞分化。有一些细胞周期相关蛋白，包括CDK抑制因子，可以使成体干细胞处于静止状态，其他综述中会有详细描述。
图4. 神经发育与细胞周期
结论与展望
该领域中仍有许多非常重要的问题亟待解答，如：在ESCs和iPSCs中的细胞周期机制是否在维持多能性方面起着直接作用？细胞周期相关蛋白的时相性和区域性表达是否与干细胞内的异质性有关？当细胞的多能性消失，细胞周期的重组代表细胞分化的原因还是结果？Cyclins如何在细胞命运特化和分化过程中起发挥功能？Cdk1和cdk2的高激酶活性在多能性ESCs中的生理作用是什么？Cyclins/Cdks在干细胞中所磷酸化的底物与体细胞相比有什么不同和生物学意义？尽管目前研究手段和方法日新月异，如各种组学，三维染色质构象研究，单细胞分析等，已经在细胞多能性和分化领域做出了极大的贡献，但我们仍需进一步对干细胞的细胞周期机制的进行探究，阐明细胞周期蛋白在干细胞自我更新、分化和重编程中的分子功能，可能会对再生医学具有重要意义，也将对临床疾病的治疗具有重要指导价值。
作者介绍：
刘丽君，东北大学生命科学与健康学院教授（2018~至今），主要研究细胞周期蛋白在发育、疾病和再生中的功能和相关机制。其团队利用遗传学基因工程技术和小鼠模型，结合组学的方法，致力于解决如下地科学问题：1）发育过程中，细胞周期蛋白如何参与细胞分化和命运决定。2）个体发育成熟后，细胞周期蛋白与静息期细胞的状态维持和行使正常功能有何关系。3）在静息期细胞状态变化时，如组织器官受损伤后的再生或肿瘤发生时，细胞周期蛋白又扮演着什么角色。相关研究成果将有助于阐明发育过程的调控，并为组织再生和肿瘤发生提供重要的理论基础。
图：刘丽君教授实验室成员。前排最中间为刘丽君教授
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